Long Liu, Yanfeng Liu, Jianghua Li e Guocheng Du
A N-acetil glucosamina (GlcNAc) é um composto farmaceuticamente e nutraceuticamente importante com amplas aplicações e é agora produzido principalmente por hidrólise de cascas de caranguejo e camarão, o que pode causar poluição ambiental grave e apresentar um risco potencial de reações alérgicas. Neste trabalho, conseguimos a sobreprodução de GlcNAc por engenharia metabólica de sistemas de Bacillus subtilis, uma estirpe geralmente considerada segura. Especificamente, a via de síntese de GlcNAc foi fortalecida pela co-expressão de Glucosamina-6-fosfato (GlmS) sintase e GlcNAc-6-fosfato N-acetil transferase (GNA1) que realizaram a produção de GlcNAc (240 mg/L). De seguida, a via de captação de GlcNAc e a via de degradação intracelular foram totalmente bloqueadas por knockout de todos os genes codificadores da via catabólica de GlcNAc para facilitar a acumulação de GlcNAc. De seguida, para equilibrar e fortalecer a via sintética de GlcNAc, foi introduzido um sistema de andaime guiado por ADN e aumentou o título de GlcNAc de 1,83 g/L para 4,55 g/L. Foram então empregues pequenos ARN reguladores sintéticos para otimizar o nível de expressão de enzimas chave nos nós da rede relacionada com o GlcNAc, incluindo a 6-fosfofrutoquinase (Pfk) e a fosfoglucosamina mutase (GlmM). O título de GlcNAc foi melhorado para 8,30 g/L pela regulação modular das atividades dos módulos relacionados com o GlcNAc. Na fermentação em batelada alimentada, o título de GlcNAc foi ainda aumentado para 31,65 g/L, o que foi 3,8 vezes superior ao do frasco de agitação. Por fim, para compreender a cinética das alterações metabólicas na via de síntese de GlcNAc e na glicólise, foram implementadas a metabolómica dirigida e a marcação dinâmica. A desfosforilação ineficiente de GlcNAc6P e a fosforilação indesejada de GlcNAc foram identificadas como etapa limitante da taxa para a síntese de GlcNAc, que apontou a direção futura para uma maior otimização da via. As estratégias de engenharia metabólica dos sistemas utilizados podem ser úteis para a construção de fábricas versáteis de células de B. subtilis para a produção de outros produtos químicos industrialmente importantes. Os polímeros de alta resistência, como as fibras de aramida, são materiais importantes na tecnologia espacial. Para obter estes materiais em locais remotos, como Marte, a produção biológica é de interesse. O precursor do polímero aromático para o ácido aminobenzóico (pABA) pode ser derivado da via do chiquimato através da engenharia metabólica de Bacillus subtilis, um organismo adequado para a biologia sintética espacial. A nossa estratégia de engenharia incluiu a reparação da sintase defeituosa de indol 3 glicerol fosfato sintase (trpC), o knockout de uma isozima corismato mutase (aroH) e a sobreexpressão da aminodesoxicorismato sintase (pabAB) e da aminodesoxicorismato liase (pabC) das bactérias Corynebacterium callunae e Xenorhabdus bovienii respectivamente. Além disso, foi criada uma enzima proteica de fusão (pabABC) para canalizar o fluxo de carbono. Utilizando a evolução adaptativa foram criados mutantes da estirpe de produção capazes de metabolizar a xiloseexplorar e comparar a capacidade de produção de pABA a partir de diferentes fontes de carbono. Em vez da eficiência do substrato ou do desempenho da via bioquímica, a toxicidade do produto, que era fortemente dependente do pH, parecia ser o fator limitante global. O título mais elevado alcançado em frascos agitados foi de 3,22 gl-1 com um rendimento em carbono de 12,4% [C†mol/C†mol] a partir de um aminoaçúcar. Isto promete a adequação do sistema para utilização de recursos in situ (ISRU) em biotecnologia espacial, onde as matérias-primas que podem ser derivadas de lisado de células cianobacterianas desempenham um papel. são potencialmente de importância ainda maior na tecnologia espacial. O tereftalato de polietileno orientado biaxialmente (BoPET, nome comercial Mylar®) é valorizado pela sua elevada resistência à tracção, estabilidade química e dimensional, propriedades de barreira e isolamento eléctrico; camadas de BoPET metalizado são, por exemplo, utilizadas em balões de alta altitude, bem como em fatos espaciais para isolamento térmico e resistência à radiação. As aramidas, bem como o tecido e o material em folha Kevlar®, apresentam propriedades igualmente excelentes, incluindo elevada tenacidade e módulo de resistência, baixa fadiga por flexão, bem como excelente estabilidade química e térmica e também resistência à radiação. Por conseguinte, são ideais para uma variedade de aplicações especializadas, incluindo a proteção balística. O facto de estes materiais serem especialmente adequados para a construção de fatos ambientais e habitações em tecnologia espacial mostra a sua utilização em naves insufláveis ??como as da Bigelow Aerospace® (NASA, 2017). combustíveis fósseis, o que não é nem sustentável a longo prazo na Terra, nem está disponível no espaço ou em destinos como a Lua da Terra ou Marte. A Engenharia Metabólica pode fornecer a tecnologia para resolver este problema, permitindo a produção de precursores de biosubstituição através da utilização de recursos in situ (ISRU). A ISRU visa utilizar a biologia sintética para reabastecer as commodities em missões de exploração do espaço profundo (Rothschild, 2016). As vias metabólicas microbianas dão origem a muitos compostos que podem potencialmente substituir os produtos químicos atualmente baseados no petróleo por derivados bio. los por alternativas de base biológica. Isto inclui uma infinidade de compostos aromáticos e derivados de aromáticos (Averesch e Krömer, 2018). O intermediário da via do chiquimato para-ácido aminobenzóico (pABA) é um desses aromáticos com aplicabilidade versátil – tem vindo a ser utilizado como agente de ligação cruzada para resinas e corantes, precursor na indústria farmacêutica e como agente terapêutico propriamente dito (por exemplo, como o medicamento POTABA®). O pABA pode também ser convertido em ácido tereftálico (Farlow e Krömer, 2016), como matéria-prima para a produção de PET/Mylar®. Também pode ser possível converter o pABA em para-fenilenodiamina (por ex.via reação de Kochi ou Hunsdiecker seguida de substituição nucleofílica), que é (para além do ácido tereftálico) o segundo monómero da fibra de aramida Kevlar®. Além disso, o pABA também pode ser polimerizado consigo próprio (Morgan, 1977), produzindo potencialmente uma para-aramida com uma estrutura molecular análoga ao Kevlar®. A viabilidade de produzir pABA microbiologicamente para ser utilizado como precursor industrial foi mostrada pela primeira vez . Num estudo de seguimento dedicado, o título pode ser aumentado para 0,22 gl-1 (1,57 mM) a partir de glicerol/etanol (Averesch et al., 2016). Além disso, as bactérias têm sido utilizadas para a produção de pABA. Em Escherichia coli, foi atingida uma concentração de 4,8 gl-1 (35 mM) a partir da glicose (Koma et al., 2014), enquanto a maior produção até à data foi atingida com Corynebacterium glutamicum, atingindo 43,06 gl -1 (314 mM) de glicose (Kubota et al., 2016). Para alavancar esta tecnologia no espaço e, em última análise, permitir a síntese de fibras de aramida, seria altamente desejável produzir pABA em Bacillus subtilis, o organismo mais adequado para a biologia sintética espacial. O Bacillus subtilis forma endósporos (Nicholson et al., 2000; Horneck et al., 2010), que são extremamente resistentes a diversos parâmetros ambientais como a seca, a salinidade, o pH e os solventes e permanecem viáveis ??durante décadas; desde que protegidos da radiação UV, suportam até o vácuo do espaço (Horneck, 1993). Biografia Long Liu é atualmente professor vitalício na Escola de Biotecnologia da Universidade de Jiangnan, Wuxi, China. Tem trabalhado na área da engenharia de bioprocessos e da engenharia metabólica com especial referência à optimização e controlo de bioprocessos. É autor de 2 livros, 3 capítulos de livros, 7 artigos de revisão, 20 patentes, 37 artigos de investigação em revistas SCI e 10 artigos em conferências. Recebeu o Primeiro Prémio de Progresso em Ciência e Tecnologia, Jiangsu, China (2010), Primeiro Prémio de Progresso em Ciência e Tecnologia, Federação da Indústria Química e Petrolífera da China (2011), o Prémio de Invenção Tecnológica do Conselho Nacional da Indústria Ligeira da China ( 2013) e Excelente Jovem Professor de Jiangsu, China (2014). longliu@jiangnan.edu.cnAlém disso, as bactérias têm sido utilizadas para a produção de pABA. Em Escherichia coli, foi atingida uma concentração de 4,8 gl-1 (35 mM) a partir da glicose (Koma et al., 2014), enquanto a maior produção até à data foi atingida com Corynebacterium glutamicum, atingindo 43,06 gl -1 (314 mM) de glicose (Kubota et al., 2016). Para alavancar esta tecnologia no espaço e, em última análise, permitir a síntese de fibras de aramida, seria altamente desejável produzir pABA em Bacillus subtilis, o organismo mais adequado para a biologia sintética espacial. O Bacillus subtilis forma endósporos (Nicholson et al., 2000; Horneck et al., 2010), que são extremamente resistentes a diversos parâmetros ambientais como a seca, a salinidade, o pH e os solventes e permanecem viáveis ??durante décadas; desde que protegidos da radiação UV, suportam até o vácuo do espaço (Horneck, 1993). Biografia Long Liu é atualmente professor vitalício na Escola de Biotecnologia da Universidade de Jiangnan, Wuxi, China. Tem trabalhado na área da engenharia de bioprocessos e da engenharia metabólica com especial referência à optimização e controlo de bioprocessos. É autor de 2 livros, 3 capítulos de livros, 7 artigos de revisão, 20 patentes, 37 artigos de investigação em revistas SCI e 10 artigos em conferências. Recebeu o Primeiro Prémio de Progresso em Ciência e Tecnologia, Jiangsu, China (2010), Primeiro Prémio de Progresso em Ciência e Tecnologia, Federação da Indústria Química e Petrolífera da China (2011), o Prémio de Invenção Tecnológica do Conselho Nacional da Indústria Ligeira da China ( 2013) e Excelente Jovem Professor de Jiangsu, China (2014). longliu@jiangnan.edu.cnAlém disso, as bactérias têm sido utilizadas para a produção de pABA. Em Escherichia coli, foi atingida uma concentração de 4,8 gl-1 (35 mM) a partir da glicose (Koma et al., 2014), enquanto a maior produção até à data foi atingida com Corynebacterium glutamicum, atingindo 43,06 gl -1 (314 mM) de glicose (Kubota et al., 2016). Para alavancar esta tecnologia no espaço e, em última análise, permitir a síntese de fibras de aramida, seria altamente desejável produzir pABA em Bacillus subtilis, o organismo mais adequado para a biologia sintética espacial. O Bacillus subtilis forma endósporos (Nicholson et al., 2000; Horneck et al., 2010), que são extremamente resistentes a diversos parâmetros ambientais como a seca, a salinidade, o pH e os solventes e permanecem viáveis ??durante décadas; desde que protegidos da radiação UV, suportam até o vácuo do espaço (Horneck, 1993). Biografia Long Liu é atualmente professor vitalício na Escola de Biotecnologia da Universidade de Jiangnan, Wuxi, China. Tem trabalhado na área da engenharia de bioprocessos e da engenharia metabólica com especial referência à optimização e controlo de bioprocessos. É autor de 2 livros, 3 capítulos de livros, 7 artigos de revisão, 20 patentes, 37 artigos de investigação em revistas SCI e 10 artigos em conferências. Recebeu o Primeiro Prémio de Progresso em Ciência e Tecnologia, Jiangsu, China (2010), Primeiro Prémio de Progresso em Ciência e Tecnologia, Federação da Indústria Química e Petrolífera da China (2011), o Prémio de Invenção Tecnológica do Conselho Nacional da Indústria Ligeira da China ( 2013) e Excelente Jovem Professor de Jiangsu, China (2014). longliu@jiangnan.edu.cnPrimeiro prémio de Progresso em Ciência e Tecnologia, Federação da Indústria Química e Petrolífera da China (2011), Prémio de Invenção Tecnológica do Conselho Nacional da Indústria Ligeira da China (2013) e Excelente Jovem Professor de Jiangsu, China (2014). longliu@jiangnan.edu.cnPrimeiro prémio de Progresso em Ciência e Tecnologia, Federação da Indústria Química e Petrolífera da China (2011), Prémio de Invenção Tecnológica do Conselho Nacional da Indústria Ligeira da China (2013) e Excelente Jovem Professor de Jiangsu, China (2014). longliu@jiangnan.edu.cn
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