Fatemeh Davam Pasteur
Resumo: Hoje em dia, quase 60-70% das proteínas recombinantes são produzidas corretamente em células CHO. A otimização das condições de subcultura celular para o aumento e produtividade das células recombinantes de ovário de hamster chinês (CHO) é uma etapa essencial no fabrico biofarmacêutico. expressão breve da proteína (expressão génica temporária) A TGE é a forma preferencial de explicitar as proteínas recombinantes num curto espaço de tempo e numa escala apropriada para testes pré-médicos. No presente estudo foi avaliado o impacto da optimização da situação de transfecção num meio solto de soro CD DG44 numa incubadora de agitação com células CHO DG44 em situação suspensa. Uma gama de valores para o ADN, PEI e consciência celular foi estudada para encontrar valores superiores em relação à eficiência de transfecção. Os efeitos confirmaram que os valores otimizados foram de 1. Cinco μg/106 células de reagente de transfeção (PEI), 0,5*106 células para iniciar as densidades celulares e 2 μg/106 células de ADN com 28,71, 38,68 e 52,8% de transfecção desempenho respectivamente. além disso, com base totalmente naquela situação otimizada por TGE, foi avaliado o impacto da alimentação com 6 peptonas exclusivas de soja e caseína no desempenho da transfeção Os resultados da alimentação peptonada com peptonas Caseína Triptona N1, Peptona de Soja A2Sc e Peptona de Soja. E110 apresentaram 59,88%, 58,28% e uma eficiência de transfecção de sessenta e oito,66% com um crescimento de 15,44, 12,35 e 28,55% em comparação com o processo otimizado anterior. estes factos indicam que a melhor abordagem de alimentação é capaz de aumentar o desempenho da transfecção e é uma abordagem promissora para otimizar o processo de TGE. na última década, a TGE tem sido um método amplamente utilizado para a rápida fabricação de proteínas recombinantes em células de mamíferos. Apesar de várias pesquisas feitas para melhorar esta tecnologia em termos de escalabilidade e produtividade, os melhores rendimentos de produção de TGE geralmente permanecem mais baixos em comparação com os valores obtidos com estirpes móveis estáveis. Considerando o importante papel das células CHO como o hospedeiro mais comum para a produção de proteínas curativas, é preferível ter uma abordagem TGE otimizada para a geração de uma quantidade suficiente de proteína recombinante para investigações pré-clínicas. desta forma, não é vital para os grupos biofarmacêuticos substituir a sua linha celular de origem pré-clínica de proteína recombinante por outra linha celular transfectada de forma estável para o último produto. O desempenho da transfecção é um dos elementos vitais que afetam os resultados do TGE. Otimizando a quantidade de reagente de transfeção PEI, iniciando as densidades celulares, o plasmídeo de ADN demonstrou ter excelentes resultados na eficiência da transfeção. no entanto, por vezes os estudos de optimização foram concluídos na linha celular HEK (com maiores taxas de transfecção) e os poucos estudos na linha celular CHO ainda não foram um sucesso na obtenção de valores tão elevados como as células HEK. além disso,A condição otimizada depende também do tamanho e das características do plasmídeo de ADN e da sua compatibilidade com a linhagem celular, pelo que é fundamental estabelecer um método de TGE otimizado para cada proteína recombinante alvo. A elevada densidade celular utilizada no decorrer da transfecção aumentará a possibilidade de exposições móveis a poliplexos PEI-DNA, e nas situações hipotérmicas do estilo de vida, as células persistiriam em depleções de nutrientes, uma vez que estão bloqueadas numa fase G1 com menos exigência por vitaminas A Expressão Génica Temporária (TGE) é uma tecnologia adequadamente instalada para a produção rápida de quantidades de miligramas a gramas de proteínas recombinantes em linhas celulares de Rim Embrionário Humano (HEK) e de Ovário de Hamster Chinês (CHO) (1–3 ). devido ao curto volume de negócios e ao preço do café, a plataforma TGE desempenha um papel mais importante nos níveis de desenvolvimento biofarmacêutico precoce por duas razões; Em primeiro lugar, é fundamental que as grandes empresas biofarmacêuticas apresentem mais do que um candidato a medicamento antes de avançarem para o processo formal de desenvolvimento. Considerando o facto de que as células CHO são os hospedeiros dominantes para a produção de proteínas recombinantes em empresas biofarmacêuticas de ponta, seria útil otimizar a técnica TGE para esta linha celular para que se possa ter a capacidade de extrapolar os registos para células estáveis. da linha. Devido aos muitos riscos associados à utilização de soro em culturas celulares, os bioprocessos industriais baseiam-se agora principalmente em meios isentos de soro (SFM) e, mais comummente, em meios isentos de aditivos animais, que têm vantagens económicas e de proteção sobre os produtos de origem animal . A necessidade de limitar os aditivos de origem animal no processo de fabrico criou um interesse na utilização de hidrolisados ??proteicos (peptonas) como suplementos de oportunidade para atualizar o soro. As peptonas são hidrolisados ??de proteínas solúveis em água de natureza não descrita quimicamente, contendo peptídeos, aminoácidos e sais inorgânicos, mas sem lípidos e açúcares. para a cultura aprofundada de células animais que fornecem vitaminas ou melhoram análogos com base no grau de hidrólise (2, 12). Diversas peptonas estão disponíveis comercialmente juntamente com a digestão de tecidos bovinos, carne, caseína, lactoalbumina e levedura. a principal desvantagem da maioria destas peptonas é a sua origem animal, o que põe em perigo a biossegurança média. A suplementação de meios livres de proteínas populares com peptonas demonstrou causar um grande aumento na produtividade de TGE em células HEK 293-EBNA (13, 14). Este efeito foi também estudado em estirpes celulares sólidas CHO (15, dezasseis). no entanto, tanto quanto sabemos, ainda não foi realizado nenhum estudo para investigar o efeito dos suplementos de peptona nas células CHO na expressão temporária da proteína recombinante. neste olhar,foram feitos esforços para identificar o cenário TGE de primeira linha em relação ao PEI, ao reconhecimento do ADN e à densidade celular. Além disso, foi aplicada uma estratégia de alimentação à linha móvel CHO DG44 recombinante para produzir uma forma quimérica truncada única de ativador de plasminogénio tecidual. Apesar dos melhores rendimentos de TGE explicados no artigo, também vale a pena mencionar que a passagem regular do cultivo celular e o tratamento limpo da solução de stock de PEI devem desempenhar um papel crucial na obtenção de elevadas eficiências de transfecção e títulos de proteínas recombinantes . Além disso, existem ainda estrangulamentos como a necessidade de troca de meios durante a transfecção ou reconhecimento de células antes da transfecção, que são importantes a ter em conta para que possa torná-la uma abordagem viável de alto nível. f.davami@gmail.com