Abstrato

Biotecnologia-2013: Otimização de TGE (Transient Genetic Expression) com estratégia de alimentação de peptona para a produção de proteína recombinante em culturas de células de mamíferos - Fatemeh Davam Pasteur - Instituto do Irão

Fatemeh Davam Pasteur 

 Resumo: Hoje em dia, quase 60-70% das proteínas recombinantes são produzidas corretamente em células CHO. A otimização das condições de subcultura celular para o aumento e produtividade das células recombinantes de ovário de hamster chinês (CHO) é uma etapa essencial no fabrico biofarmacêutico. expressão breve da proteína (expressão génica temporária) A TGE é a forma preferencial de explicitar as proteínas recombinantes num curto espaço de tempo e numa escala apropriada para testes pré-médicos. No presente estudo foi avaliado o impacto da optimização da situação de transfecção num meio solto de soro CD DG44 numa incubadora de agitação com células CHO DG44 em situação suspensa. Uma gama de valores para o ADN, PEI e consciência celular foi estudada para encontrar valores superiores em relação à eficiência de transfecção. Os efeitos confirmaram que os valores otimizados foram de 1. Cinco μg/106 células de reagente de transfeção (PEI), 0,5*106 células para iniciar as densidades celulares e 2 μg/106 células de ADN com 28,71, 38,68 e 52,8% de transfecção desempenho respectivamente. além disso, com base totalmente naquela situação otimizada por TGE, foi avaliado o impacto da alimentação com 6 peptonas exclusivas de soja e caseína no desempenho da transfeção Os resultados da alimentação peptonada com peptonas Caseína Triptona N1, Peptona de Soja A2Sc e Peptona de Soja. E110 apresentaram 59,88%, 58,28% e uma eficiência de transfecção de sessenta e oito,66% com um crescimento de 15,44, 12,35 e 28,55% em comparação com o processo otimizado anterior. estes factos indicam que a melhor abordagem de alimentação é capaz de aumentar o desempenho da transfecção e é uma abordagem promissora para otimizar o processo de TGE. na última década, a TGE tem sido um método amplamente utilizado para a rápida fabricação de proteínas recombinantes em células de mamíferos. Apesar de várias pesquisas feitas para melhorar esta tecnologia em termos de escalabilidade e produtividade, os melhores rendimentos de produção de TGE geralmente permanecem mais baixos em comparação com os valores obtidos com estirpes móveis estáveis. Considerando o importante papel das células CHO como o hospedeiro mais comum para a produção de proteínas curativas, é preferível ter uma abordagem TGE otimizada para a geração de uma quantidade suficiente de proteína recombinante para investigações pré-clínicas. desta forma, não é vital para os grupos biofarmacêuticos substituir a sua linha celular de origem pré-clínica de proteína recombinante por outra linha celular transfectada de forma estável para o último produto. O desempenho da transfecção é um dos elementos vitais que afetam os resultados do TGE. Otimizando a quantidade de reagente de transfeção PEI, iniciando as densidades celulares, o plasmídeo de ADN demonstrou ter excelentes resultados na eficiência da transfeção. no entanto, por vezes os estudos de optimização foram concluídos na linha celular HEK (com maiores taxas de transfecção) e os poucos estudos na linha celular CHO ainda não foram um sucesso na obtenção de valores tão elevados como as células HEK. além disso,A condição otimizada depende também do tamanho e das características do plasmídeo de ADN e da sua compatibilidade com a linhagem celular, pelo que é fundamental estabelecer um método de TGE otimizado para cada proteína recombinante alvo. A elevada densidade celular utilizada no decorrer da transfecção aumentará a possibilidade de exposições móveis a poliplexos PEI-DNA, e nas situações hipotérmicas do estilo de vida, as células persistiriam em depleções de nutrientes, uma vez que estão bloqueadas numa fase G1 com menos exigência por vitaminas A Expressão Génica Temporária (TGE) é uma tecnologia adequadamente instalada para a produção rápida de quantidades de miligramas a gramas de proteínas recombinantes em linhas celulares de Rim Embrionário Humano (HEK) e de Ovário de Hamster Chinês (CHO) (1–3 ). devido ao curto volume de negócios e ao preço do café, a plataforma TGE desempenha um papel mais importante nos níveis de desenvolvimento biofarmacêutico precoce por duas razões; Em primeiro lugar, é fundamental que as grandes empresas biofarmacêuticas apresentem mais do que um candidato a medicamento antes de avançarem para o processo formal de desenvolvimento. Considerando o facto de que as células CHO são os hospedeiros dominantes para a produção de proteínas recombinantes em empresas biofarmacêuticas de ponta, seria útil otimizar a técnica TGE para esta linha celular para que se possa ter a capacidade de extrapolar os registos para células estáveis. da linha. Devido aos muitos riscos associados à utilização de soro em culturas celulares, os bioprocessos industriais baseiam-se agora principalmente em meios isentos de soro (SFM) e, mais comummente, em meios isentos de aditivos animais, que têm vantagens económicas e de proteção sobre os produtos de origem animal . A necessidade de limitar os aditivos de origem animal no processo de fabrico criou um interesse na utilização de hidrolisados ??proteicos (peptonas) como suplementos de oportunidade para atualizar o soro. As peptonas são hidrolisados ??de proteínas solúveis em água de natureza não descrita quimicamente, contendo peptídeos, aminoácidos e sais inorgânicos, mas sem lípidos e açúcares. para a cultura aprofundada de células animais que fornecem vitaminas ou melhoram análogos com base no grau de hidrólise (2, 12). Diversas peptonas estão disponíveis comercialmente juntamente com a digestão de tecidos bovinos, carne, caseína, lactoalbumina e levedura. a principal desvantagem da maioria destas peptonas é a sua origem animal, o que põe em perigo a biossegurança média. A suplementação de meios livres de proteínas populares com peptonas demonstrou causar um grande aumento na produtividade de TGE em células HEK 293-EBNA (13, 14). Este efeito foi também estudado em estirpes celulares sólidas CHO (15, dezasseis). no entanto, tanto quanto sabemos, ainda não foi realizado nenhum estudo para investigar o efeito dos suplementos de peptona nas células CHO na expressão temporária da proteína recombinante. neste olhar,foram feitos esforços para identificar o cenário TGE de primeira linha em relação ao PEI, ao reconhecimento do ADN e à densidade celular. Além disso, foi aplicada uma estratégia de alimentação à linha móvel CHO DG44 recombinante para produzir uma forma quimérica truncada única de ativador de plasminogénio tecidual. Apesar dos melhores rendimentos de TGE explicados no artigo, também vale a pena mencionar que a passagem regular do cultivo celular e o tratamento limpo da solução de stock de PEI devem desempenhar um papel crucial na obtenção de elevadas eficiências de transfecção e títulos de proteínas recombinantes . Além disso, existem ainda estrangulamentos como a necessidade de troca de meios durante a transfecção ou reconhecimento de células antes da transfecção, que são importantes a ter em conta para que possa torná-la uma abordagem viável de alto nível. f.davami@gmail.com 

Isenção de responsabilidade: Este resumo foi traduzido usando ferramentas de inteligência artificial e ainda não foi revisado ou verificado

Indexado em

Google Scholar
Open J Gate
ResearchBible
CiteFactor
Cosmos IF
RefSeek
Hamdard University
Scholarsteer
International Innovative Journal Impact Factor (IIJIF)
International Institute of Organised Research (I2OR)
Cosmos
Geneva Foundation for Medical Education and Research

Veja mais