Abstrato

Biotecnologia-2013: C-SLGE- Clonagem do gene da lipase de Saccharomyces cerevisiae em E. coli nissle 1917 (probiótico) - Gadangi Indira - Kakatiya University

 Gadangi Indira

 As enzimas lipases podem aumentar o custo nutricional dos alimentos e desempenhar papéis cruciais na digestão, transporte e processamento dos lípidos nutricionais (por exemplo, triglicéridos, gorduras, óleos) na maioria, senão em todos, os organismos vivos. Escherichia coli Nissle 1917 é um microrganismo probiótico formador de esporos. Em resumo, pretendemos clonar e explicitar o gene da lipase em E. coli Nissle 1917 para criar melhores probióticos. O gene da lipase de Saccharomyces cerevisiae foi clonado e inserido no vetor pUC18 e depois transferido para E. coli através de transformação. A análise de inserção e PCR do pUC18 de E. coli Nissle 1917 recombinante mostrou o fragmento do gene da Lipase em electroforese em gel de agarose e localizado em quase 1,4 kb. O gene da lipase clonado em E. coli Nissle 1917 confirmou a paixão pela enzima lipase enquanto crescia em meio suplementado com fornecimento de lípidos. E.coli Nissle 1917 recombinante examinado para lipase hobby em placas de teste a pH diferente (quatro, 5, 6, 7, 8, 9, 10) para obter qualquer conversão a pH superior à linha da enzima no novo hospedeiro e Lipase O interesse foi determinado mais nas placas de PH ácido do que o PH simples e de melhor qualidade foi localizado em 6. O vetor escolhido para o desenvolvimento da biblioteca de leveduras foi o plasmídeo híbrido YCp5O (Fig. 1). O YCp5O consiste no local de início da replicação do pBR322 e nos genes para Ampr e Tetr. A inserção no site BamHI de YCp5O renderiza o plasmídeo Tets. O YCp5O inclui adicionalmente um replicador de levedura, ARSI, e um marcador selecionável em levedura, URA3. subsequentemente, o plasmídeo inclui o fragmento CEN4 de levedura de 1,8 kb que abrange o centrómero do cromossoma IV. Optámos por aplicar o plasmídeo contendo centrómero, uma vez que as frequências de transformação e a estabilidade dos transformantes adquiridos são mais elevadas do que com vetores contendo ARS ou 2, um. Isto tem o importante resultado de que cada uma das algumas alterações de levedura necessárias para separar e caracterizar genes é melhorada em pelo menos uma tarde. além disso, no início, não sabíamos se o gene CDC8 poderia ser mortal em doses genéticas elevadas. YCp5O tem um número duplicado de 1. A biblioteca foi construída através de uma pequena alteração do procedimento de Nasmyth e Reed (21), tal como definido em materiais e técnicas. porque o conjunto continha pelo menos 1,7 x 104 clones recombinantes, existem aproximadamente seis genomas de levedura nesta biblioteca. Isolamento de plasmídeos contendo CDC8. quando utilizado para converter CLK6 ura3 cdc8, o ADN organizado a partir do conjunto híbrido de levedura YCp5O rendeu aproximadamente 103 transformantes URA+ de acordo com, ug, dos quais 0,04% foram capazes de se desenvolver à temperatura não permissiva (37°C) . O ADN é organizado a partir de 4 dos transformantes de levedura URA' CDC' e administrado em E. coli através de transformação para resistência à ampicilina. O ADN plasmidial foi preparado a partir de transformantes Ampr e analisado por digestão com endonuclease de restrição observada por electroforese em gel de agarose.como todos os quatro plasmídeos tinham mapas de enzimas restritas iguais, o mais simples, e clonámos um gene que melhora os mutantes cdc8 e que está fisicamente relacionado com o locus SUP4. A posição do mapa do gene clonado confirma a sua identidade com o gene CDC8. A biblioteca que aqui descrevemos também deveria ser útil na clonagem de genes que seriam mortais em doses elevadas; a transformação de alta frequência é finalizada com o vetor centrómero; no entanto, o número de réplica intracelular é de 1. Uma localização interessante é que o fragmento mínimo capaz de complementar a mutação cdc8 tem 750 pb de comprimento. tendo em conta que os plasmídeos contendo esta pequena inserção foram capazes de remodelar com a mesma frequência elevada que os plasmídeos contendo CDC8. O plasmídeo pSU4 foi clivado com a nuclease limite BamHI, e o fragmento contendo os genes SUP4 e CDC8 foi reclonado no plasmídeo YCp5O. O YCp5O é digerido com endonuclease BamHI e tratado com fosfatase alcalina para evitar a ligação do ADN do vetor na ausência de uma inserção. As ligaduras foram terminadas num único dia a 15°C, utilizando a T4 DNA ligase; o agregado de resposta continha 1 µg de ADN vectorial e zero, cinco µg de pSU4 em 50 µl de Tris-cloridrato 66 mM (pH 7,6) - sessenta e seis mM MgCl2-10 mM ditiotreitol-1 mM ATP. O plasmídeo resultante, YCp5O-S4 CDC8, demonstrou conter sítios BamHI, e a orientação do fragmento inserido foi determinada pela análise de digestão com endonuclease de restrição. segmentos massivos de ADN flanqueantes, parece provável que este fragmento incorpore o gene CDC8 completo. no entanto, esta região codificante pode geralmente fornecer apenas uma proteína de 27.000 dalton. Com o recurso a ensaios de complementação, outros purificaram a proteína CDC8 até à homogeneidade e descobriram um peso molecular monomérico de 34.000 a quarenta.000 (1). é muito possível que tenhamos identificado um fragmento da proteína CDC8 que seja activo por si só ou complementando a proteína sensível à temperatura no mutante. (A possibilidade de o pequeno fragmento do gene estar a dar transformantes a 370C através da característica distintiva de recombinação entre o plasmídeo e o gene mutante em vez de complementação é tornada improvável pela elevada frequência de transformação e pelo facto de as células que segregaram o fenótipo URA + após o crescimento em meio rico são mais uma vez sensíveis à temperatura e que esta segregação ocorre com a frequência característica da perda de plasmídeo auto-suficiente em oposição à falta de plasmídeos incluídos.) Sequenciação de nucleótidos do fragmento pequeno e purificação do produto do gene CDC8 sobreproduzido a partir de células contendo o plasmídeo CDC8 deverá resolver estas questões. Biografia Gadangi Indira concluiu o seu doutoramento. no estudo abrangente de dermatofitose do distrito de Warangal, AP da Universidade Kakatiya e atualmente a trabalhar num projeto de investigação Mjor financiado pela UGC.É HOD do Departamento de Microbiologia em Pingle Govt UG e PG College em Warangal. Publicou mais de 15 artigos em revistas de renome, atas de seminários nacionais e internacionais. gadangi.indira@gmail.com