Ronnie W. Heiniger
The introduction of genetically-engineered (GE) plants that produce proteins that have pharmaceutical uses for improving human health or reducing diseases depends upon production systems capable of producing these GE plants in controlled conditions that prevent the movement of genetic materials from the target plant into the ambiente. Como resultado da preocupação pública com a administração da biotecnologia nos EUA, o USDA-APHIS desenvolveu o programa Biotechnology Quality Management System (BQMS). O BQMS é um programa federal concebido para melhorar a gestão de organismos geneticamente modificados através de educação intensiva, monitorização e supervisão de todos os aspetos do processo, desde o laboratório até ao campo. O Programa BQMS ajuda as organizações envolvidas na investigação e desenvolvimento de biotecnologia, incluindo pequenas empresas e investigadores académicos, a analisar os pontos críticos de controlo dentro dos seus sistemas de gestão para melhor manter a conformidade com os regulamentos APHIS (7 CFR parte 340) para a importação , movimento interestadual e libertação em campo de organismos geneticamente modificados (GE) regulamentados. Infelizmente, o programa BQMS não aborda um dos elos mais importantes do processo produtivo – o produtor. Para corrigir esta deficiência, a Universidade Estadual da Carolina do Norte, em cooperação com o Centro de Biotecnologia da Carolina do Norte e a Corporação de Desenvolvimento Económico do Nordeste, desenvolveu um programa de certificação de produtores denominado B-Cert. O programa B-Cert reúne os procedimentos necessários para evitar a perda de materiais genéticos do local alvo, os padrões de certificação e os requisitos estabelecidos pelo USDA-APHIS para o cultivo de culturas transgénicas para desenvolver diretrizes e padrões para a gestão das culturas, requisitos de isolamento, saneamento de equipamentos, salvaguardas ambientais, requisitos de manutenção de registos e outros processos críticos. expressámos víscera de comprimento total em PCPs de N. tabacum e folhas de N. benthamiana em gamas até 7 mg/kg de produto purificado. A expressão das cadeias A e B também se tornou possível em ambos os sistemas, mas o rendimento do produto heterodimérico diminuiu até 0,97 g/g, enquanto a expressão de uma cadeia por si só não produziu quantidades quantificáveis ??de proteína recombinante . O rendimento de viscumina de período completo tornou-se comparável ao das lectinas vegetais expressas em levedura, no entanto ~6 vezes menor do que as cadeias redobradas de viscumina A e B expressas em E. coli. Mas o procedimento bacteriano tem uma baixa cicatrização, exige uma ampla diluição e é complexo, enquanto a técnica baseada em plantas protege apenas metade do número de passos. De acordo com uma comparação direta de preços entre os dois métodos, o dispositivo de expressão de plantas tem atualmente um preço 50% mais barato, mas pequenas atualizações no rendimento podem reduzir os custos de produção até ~88%. Em comparação com o hospedeiro nativo V. album o método de expressão heteróloga reduziu o prazo de entrega em vários anosexpandiu a contenção, para além do rendimento área-tempo, e facilitou modificações específicas do produto. consequentemente, a geração de viscumina recombinante na vida vegetal é uma oportunidade benéfica para as estruturas microbianas e nativas. Expressamos transitoriamente a viscumina de duração completa (visFL), o uso dos cinco'UTR locais e da sequência codificante, integrados na montagem pTRAc'visFL. Além disso, expressamos a série a individual (visA) pelo uso da construção pTRAc†CHSLPH†visAA†S, ou a série a juntamente com a cadeia B separada (visB) pelo uso da construção pTRAcà ¢ â€Â CHSLPHâ€Â visBA†S em ambos os N. tabacum utilizando †2 PCPs (determinar 2a) ou no interior das folhas de flores intactas de N. benthamiana (determinar 2b) por infiltraçã o com A. tumefaciens. single†chain constructs visA and visB carried a recombinant signal peptide for secretion into the apoplast of intact plant life or into the extracellular area of through†2 suspension cells to bypass immediately self†intoxication of the respective anfitrião. Detetámos uma banda de ~30 kDa em todas as amostras através de análise de western blot 5 dias após a infiltração (dpi) utilizando uma sequência de anticorpo monoclonal único (mAb) TA-5. Esta banda migrou ligeiramente mais lentamente do que a víscera bacteriana não glicosilada numa cadeia bem conhecida (~28 kDa). Correspondeu ao comprimento esperado da sequência glicosilada da viscumina N (~30 kDa) que incorpora a massa do polipeptídeo mais 1,9 kDa representando um N glicano simples adicionado a um único local aceitador esperado online (Chauhan, Rao e Raghava, 2013) . Esta glicosilação era esperada devido ao foco vacuolar (Strasser, 2014) através de uma sequência de sinal interna da toxina temperada (Frigerio et al., 2001). o melhor rendimento da série de viscumina, em relação às unidades de infiltração alternativas, foi detectado nas amostras de visFL. nas PCPs e folhas intactas, as razões visFL:visA + visB:visA para o rendimento da série de viscumina foram de 6,8:4,0:1,0 e 35:3,5:1,0, respetivamente. nas amostras visFL e visA + visB PCP, detectámos também uma banda de ~ 65 kDa correspondente ao tamanho esperado de um heterodímero de viscumina N †glicosilada ou de um homodímero em série, como já foi referido anteriormente em E. coli (Kourmanova et al ., 2004). para além do design do gene (período completo vs. cadeias separadas), a distinção em peptídeos de sinal e 5′ UTRs pode ter afetado adicionalmente os rendimentos de uma série determinados para as três configurações de expressão (Jansing & Buyel, 2018; Baixas concentrações absolutas de proteínas também podem ter evitado a deteção de dímeros dentro das amostras visA. Biografia Ronnie W. Heiniger é professor no Departamento de Ciências Agrárias da Universidade Estadual da Carolina do Norte. Ele recebeu o seu Ph. em ecologia de culturas pela Kansas State University em 1994.Heiniger trabalhou nos últimos 15 anos como especialista em investigação e extensão no Centro de Investigação e Extensão Vernon G. James em Plymouth, NC. Heiniger é conhecido pela sua investigação aplicada e publicou mais de 30 artigos em revistas e apresentou artigos que cobrem o seu trabalho em agricultura de precisão e gestão de culturas. Heiniger recebeu o Prémio Gerold O Mott por investigação de destaque da Sociedade Americana de Agronomia e é membro da Academia de Especialistas de Extensão Extraordinária da Universidade Estadual da Carolina do Norte. Ron_Heiniger@ncsu.edu
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