Guido Krupp
Resumo A disponibilidade de mRNAs sintéticos de alta qualidade (syn-mRNAs) tem permitido progredir nas suas aplicações. O crescente interesse dos investidores privados e das grandes empresas farmacêuticas criou um novo negócio de milhares de milhões de dólares. Houve uma situação rara em que duas empresas alemãs estavam entre os três principais intervenientes neste domínio. A Amptec reconhece a sua obrigação de apoiar novos players, fornecendo produtos de mRNA personalizados e de alta qualidade. Os requisitos na aplicação da manipulação celular mediada por mRNA eram (i) expressão de antigénios em células dendríticas para vacinação em oncogénese, doenças infeciosas e prevenção de alergias; (ii) reprogramação de fibroblastos para células estaminais pluripotentes induzidas com posterior diferenciação para o tipo de célula desejado; (iii) aplicações em terapia genética. Uma visão geral recente apresenta aplicações e requisitos de qualidade de syn-mRNA correspondentes. Os symRNAs podem ser gerados por transcrição in vitro (IVT) a partir de modelos contendo o gene sintético. Em princípio, os plasmídeos linearizados podem ser utilizados como modelos. No entanto, este procedimento é dificultado por várias desvantagens, tais como a clivagem incompleta do plasmídeo, resultando numa fraca reprodutibilidade; e grandes quantidades de ADN plasmídico introduzindo componentes bacterianos indesejados com possíveis complicações de aplicações in vivo. Além disso, a atividade ideal do mRNA depende de uma cauda poli (A) muito longa e não mascarada, idealmente com 120 nucleótidos de comprimento. No entanto, longas repetições homopoliméricas são instáveis ??nas células bacterianas. Desenvolvemos um procedimento alternativo, com produtos de PCR bem definidos como modelos IVT. Esta abordagem e requisitos de qualidade detalhados para mRNAs sintéticos são apresentados. São mostrados problemas que foram observados na síntese de mRNA baseada em IVT, combinados com soluções de problemas. Tendo em conta as nucleases projetadas ou bacterianas, o desenvolvimento dos avanços na alteração do genoma abriu a oportunidade de focar e ajustar legitimamente as sucessões genómicas em praticamente todas as células eucarióticas. A alteração do genoma ampliou a nossa capacidade de explicar o comprometimento das qualidades hereditárias com as doenças, avançando na produção de modelos cada vez mais precisos de procedimentos neuróticos de células e criaturas, e começou a mostrar um potencial excepcional numa variedade de campos, que vão desde a investigação essencial à biotecnologia aplicada. Os avanços contínuos na criação de nucleases programáveis, por exemplo, nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases efetoras do tipo ativador de interpretação (TALENs) e repetição palindrómica curta agrupada rotineiramente interespaçada (CRISPR) - nucleases relacionadas com Cas, aceleraram extraordinariamente o avanço de qualidade alterando da ideia à prática clínica. Aqui, examinamos os avanços contínuos dos três avanços significativos na alteração do genoma (ZFNs, TALENs e CRISPR/Cas9) e falamos sobre as utilizações dos seus reagentes subsidiários como instrumentos de alteração da qualidade em diferentes doenças humanas e potenciais tratamentos futuros, concentrando-nos em células eucarióticas e modelos de criaturas. Afinal,damos um diagrama dos preliminares clínicos que aplicam as fases de alteração do genoma para o tratamento de doenças e uma parte das dificuldades na execução desta inovação. Ao longo dos últimos anos, o desenvolvimento transbordante da alteração do genoma alterou a investigação sobre o genoma humano, o que capacitou os examinadores para compreender com maior probabilidade o comprometimento de um único produto de qualidade com uma doença num ser vivo. Durante a década de 1970, o desenvolvimento do design genético (controlo de ADN ou ARN) criou um novo avanço na edição do genoma. 1 Com base nas nucleases construídas ou bacterianas, os avanços na alteração do genoma foram desenvolvidos a um ritmo acelerado nos últimos anos e começaram a mostrar uma utilidade invulgar em diferentes campos, desde a investigação fundamental à biotecnologia aplicada e à investigação biomédica. 2 A alteração do genoma pode ser realizada in vitro ou in vivo, transmitindo o hardware de alteração in situ, o que inclui efetivamente, remove e "altera" qualidades tal como realiza outros excecionalmente focados em modificações genómicas. 3,4 As alterações dirigidas ao ADN começam a partir da era das quebras duplas abandonadas (DSBs) acionadas por nucleases, o que leva ao incitamento de componentes de recombinação profundamente proficientes do ADN celular em células de mamíferos. 5,6 As DSB de ADN instigadas por nucleases podem ser corrigidas por um dos dois instrumentos significativos que ocorrem em praticamente todos os tipos e criaturas telefónicas: a correção coordenada por homologia (HDR) e a junção final não homólogo (NHEJ),7 ocorrendo em incorporação focada ou interrupções de qualidade , separadamente. De facto, a recombinação homóloga (HR), em que pedaços intactos de ADN homólogo são utilizados como formatos, tem sido a forma de lidar com o reconhecimento focado na expansão, substituição ou inativação da qualidade; no entanto, a utilidade da HR é vigorosamente restringida devido ao seu desperdício em células de mamíferos e organismos modelo. 8 Depois de se ter descoberto que as DSB podiam aumentar a frequência de HDR em vários graus significativos, as nucleases direcionadas foram encontradas como uma forma eletiva de lidar com o aumento da proficiência da modificação hereditária intervencionada por HDR. Quando é feito um DSB direcionado, o HDR pode recriar o ADN cortado usando um layout de ADN exógeno simples para o agrupamento de locais de rutura. Este componente pode ser utilizado para apresentar alterações exatas, transmitindo um layout de correção devidamente estruturado diretamente em células focadas,9,10 respetivamente, de forma explícita no local, provocando alteração de transformação ou inclusão de nova sucessão. Por outro lado, a correção intervencionada pelo NHEJ resultará frequentemente em erros, uma vez que solicita um arranjo proficiente de inclusão ou apagamento de qualidade (indels) em diferentes comprimentos no site DSB, o que a longo prazo causa a inativação da qualidade. 11 Se indels acontecerem em No agrupamento de codificação, haverá transformações de frameshift, que provocarão a corrupção do mRNA ou a criação de proteínas encurtadas não funcionais por decaimento intercedido por balbucio.12 Acredita-se que esta metodologia e as suas aplicações são mais simples do que as técnicas baseadas em RH, com base em que (a) não há necessidade de uma rede fixa e (b) o tipo de telefone tem menos efeito na adequação da alteração (apesar do RH , o NHEJ pode ser dinâmico durante todo o ciclo telefónico). 13 Assim, tal como o RNAi, o NHEJ pode ser aplicado em linhas celulares divinizadas para produzir a inativação de uma qualidade solitária ou de inúmeras qualidades, mas ao fazer alterações que causam perda de trabalho, pode inativação de qualidade imediata e duradoura. 9 Na fase inicial de melhoria da alteração do genoma, para iniciar os DSBs ideais em cada local alvo específico do ADN, a construção de nucleases de dedo de zinco (ZFNs)14 ou meganucleases15 inconfundíveis tem sido o centro de exploração. Estas estruturas de nuclease exigiam uma habilidade especial para criar proteínas falsas compostas por espaços explícitos de restrição de ADN de arranjo ajustável, cada um associado a uma nuclease vaga para clivagem alvo, fornecendo aos cientistas instrumentos fenomenais para realizar a manipulação hereditária. 16 Posteriormente, outra classe de Flavobacterium okeanokoites ( A área reagente FokI) obtida de proteínas bacterianas denominadas efetores semelhantes a ativadores de interpretação (TALEs) revelou insights sobre oportunidades adicionais para edição exata do genoma.17 Nucleases programáveis ??baseadas em TALE podem separar qualquer agrupamento de entusiasmo de ADN com recorrência moderadamente elevada. Não obstante, as dificuldades fundamentais para as abordagens de nucleases efetoras semelhantes a ativadores de tradução (TALEN) são o plano de uma clonagem atómica complexa para cada novo alvo de ADN e a sua baixa produtividade de triagem genómica efetivamente focada nas células. Biografia Guido Krupp é CEO e Presidente da Amptec GmbH. Doutorou-se na Universidade de Würzburg e no Instituto Max-Planck, Martinsried. Fez o seu Pós-Doutoramento na Universidade de Yale. É designado Líder do Grupo de Investigação na Universidade de Kiel. É o fundador da Artus GmbH & Amptec GmbH. Os seus interesses de investigação incluem a tecnologia de ácidos nucleicos com foco no RNA, agentes patogénicos de plantas (viróides), ribozimas e telomerase. Publicou mais de 60 publicações e foi designado Editor da Ribozyme Biochemistry & Biotechnology, e da Telomeres, Telomerases & Cancer, e Membro do Conselho Editorial da Biotechnology Annual Review. krupp@amp-tec.com9 Na fase inicial de melhoria da alteração do genoma, para iniciar os DSBs ideais em cada local alvo específico do ADN, a construção de inconfundíveis nucleases de dedo de zinco (ZFNs)14 ou meganucleases15 tem sido o centro de exploração. Estas estruturas de nuclease exigiam uma habilidade especial para criar proteínas falsas compostas por espaços explícitos de restrição de ADN de arranjo ajustável, cada um associado a uma nuclease vaga para clivagem alvo, fornecendo aos cientistas instrumentos fenomenais para realizar a manipulação hereditária. 16 Posteriormente, outra classe de Flavobacterium okeanokoites ( A área reagente FokI) obtida de proteínas bacterianas denominadas efetores semelhantes a ativadores de interpretação (TALEs) revelou insights sobre oportunidades adicionais para edição exata do genoma.17 Nucleases programáveis ??baseadas em TALE podem separar qualquer agrupamento de entusiasmo de ADN com recorrência moderadamente elevada. Não obstante, as dificuldades fundamentais para as abordagens de nucleases efetoras semelhantes a ativadores de tradução (TALEN) são o plano de uma clonagem atómica complexa para cada novo alvo de ADN e a sua baixa produtividade de triagem genómica efetivamente focada nas células. Biografia Guido Krupp é CEO e Presidente da Amptec GmbH. Doutorou-se na Universidade de Würzburg e no Instituto Max-Planck, Martinsried. Fez o seu Pós-Doutoramento na Universidade de Yale. É designado Líder do Grupo de Investigação na Universidade de Kiel. É o fundador da Artus GmbH & Amptec GmbH. Os seus interesses de investigação incluem a tecnologia de ácidos nucleicos com foco no RNA, agentes patogénicos de plantas (viróides), ribozimas e telomerase. Publicou mais de 60 publicações e foi designado Editor da Ribozyme Biochemistry & Biotechnology, e da Telomeres, Telomerases & Cancer, e Membro do Conselho Editorial da Biotechnology Annual Review. krupp@amp-tec.com9 Na fase inicial de melhoria da alteração do genoma, para iniciar os DSBs ideais em cada local alvo específico do ADN, a construção de inconfundíveis nucleases de dedo de zinco (ZFNs)14 ou meganucleases15 tem sido o centro de exploração. Estas estruturas de nuclease exigiam uma habilidade especial para criar proteínas falsas compostas por espaços explícitos de restrição de ADN de arranjo ajustável, cada um associado a uma nuclease vaga para clivagem alvo, fornecendo aos cientistas instrumentos fenomenais para realizar a manipulação hereditária. 16 Posteriormente, outra classe de Flavobacterium okeanokoites ( A área reagente FokI) obtida de proteínas bacterianas denominadas efetores semelhantes a ativadores de interpretação (TALEs) revelou insights sobre oportunidades adicionais para edição exata do genoma.17 Nucleases programáveis ??baseadas em TALE podem separar qualquer agrupamento de entusiasmo de ADN com recorrência moderadamente elevada. Não obstante, as dificuldades fundamentais para as abordagens de nucleases efetoras semelhantes a ativadores de tradução (TALEN) são o plano de uma clonagem atómica complexa para cada novo alvo de ADN e a sua baixa produtividade de triagem genómica efetivamente focada nas células. Biografia Guido Krupp é CEO e Presidente da Amptec GmbH. Doutorou-se na Universidade de Würzburg e no Instituto Max-Planck, Martinsried. Fez o seu Pós-Doutoramento na Universidade de Yale. É designado Líder do Grupo de Investigação na Universidade de Kiel. É o fundador da Artus GmbH & Amptec GmbH. Os seus interesses de investigação incluem a tecnologia de ácidos nucleicos com foco no RNA, agentes patogénicos de plantas (viróides), ribozimas e telomerase. Publicou mais de 60 publicações e foi designado Editor da Ribozyme Biochemistry & Biotechnology, e da Telomeres, Telomerases & Cancer, e Membro do Conselho Editorial da Biotechnology Annual Review. krupp@amp-tec.comas dificuldades fundamentais para as abordagens de nucleases efetoras semelhantes a ativadores de tradução (TALEN) são o plano de uma clonagem atómica complexa para cada novo alvo de ADN e a sua baixa produtividade de triagem genómica efetivamente focada nas células. Biografia Guido Krupp é CEO e Presidente da Amptec GmbH. Doutorou-se na Universidade de Würzburg e no Instituto Max-Planck, Martinsried. Fez o seu Pós-Doutoramento na Universidade de Yale. É designado Líder do Grupo de Investigação na Universidade de Kiel. É o fundador da Artus GmbH & Amptec GmbH. Os seus interesses de investigação incluem a tecnologia de ácidos nucleicos com foco no RNA, agentes patogénicos de plantas (viróides), ribozimas e telomerase. Publicou mais de 60 publicações e foi designado Editor da Ribozyme Biochemistry & Biotechnology, e da Telomeres, Telomerases & Cancer, e Membro do Conselho Editorial da Biotechnology Annual Review. krupp@amp-tec.comas dificuldades fundamentais para as abordagens de nucleases efetoras semelhantes a ativadores de tradução (TALEN) são o plano de uma clonagem atómica complexa para cada novo alvo de ADN e a sua baixa produtividade de triagem genómica efetivamente focada nas células. Biografia Guido Krupp é CEO e Presidente da Amptec GmbH. Doutorou-se na Universidade de Würzburg e no Instituto Max-Planck, Martinsried. Fez o seu Pós-Doutoramento na Universidade de Yale. É designado Líder do Grupo de Investigação na Universidade de Kiel. É o fundador da Artus GmbH & Amptec GmbH. Os seus interesses de investigação incluem a tecnologia de ácidos nucleicos com foco no RNA, agentes patogénicos de plantas (viróides), ribozimas e telomerase. Publicou mais de 60 publicações e foi designado Editor da Ribozyme Biochemistry & Biotechnology, e da Telomeres, Telomerases & Cancer, e Membro do Conselho Editorial da Biotechnology Annual Review. krupp@amp-tec.com
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