Abstrato

Um método melhorado de preparação de amostras para deteção de Plasmodium falciparum em amostras de sangue

Thavamani Rajapandi

A microscopia continua a ser o gold standard para a detecção de parasitas da malária em amostras de sangue, enquanto os testes de diagnóstico rápido (RDTs) e os métodos baseados na reacção em cadeia da polimerase (PCR) são cada vez mais utilizados para aplicações de campo, cada um com limitações. Utilizando isolados do parasita Plasmodium falciparum cultivados in vitro, analisámos vários métodos de preparação de amostras para deteção baseada em PCR. As amostras de teste submetidas a lise hipotónica, seguida de uma depleção quase completa de hemozoína (Hz) e hemoglobina (Hb) e subsequente amplificação por PCR do gene msp2 resultaram num limite de deteção que foi melhorado em relação às amostras preparadas em condições de tampão isotónico. Além disso, amplificámos sequências de vários genes alvo, incluindo msp2-, msp1-, 18S rRNA- e eba175 a partir de extratos de parasitas preparados por lise hipotónica. Identificámos um conjunto de primers que amplificavam uma região dentro de eba175 que dava um limite de deteção mais elevado de 1 parasita por 5 × 107 glóbulos vermelhos (RBCs), bem como um conjunto de primers para msp2 que dava um limite de deteção de 1 a 5 parasitas por 5 × 107 glóbulos vermelhos por análise de PCR padrão. Os restantes alvos exibiram limites máximos de deteção de 20 a 30 parasitas por 5 × 107 glóbulos vermelhos. Este método recentemente desenvolvido é 100 a 500 vezes mais sensível do que os métodos baseados em PCR atualmente disponíveis, que detetam 30 a 100 parasitas por 5 × 106 glóbulos vermelhos em 1 μl de sangue). Além disso, este método poderia ser utilizado em diagnósticos baseados em PCR implantáveis ??no terreno, bem como para a genotipagem de parasitas e controlo de qualidade de RDTs que falharam.