Abstrato

MedChem & CADD 2016: Linhas celulares estáveis ??VERO que expressam os recetores 2 e 3 do fator de crescimento epidérmico humano completo: Plataformas para a exibição subtrativa de fagos

 Akbar Hedayatizadeh-Omran 

A conversa cruzada entre os recetores 2 e 3 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2 e HER3) pode contribuir potencialmente para a resistência terapêutica no cancro da mama humano. A exibição subtrativa em fagos permite a seleção altamente específica de fragmentos de anticorpos direcionados contra a superfície das células HER2 e HER3. As estratégias para selecionar anticorpos específicos de conformação e ativação contra HER2 e HER3 requerem células que expressam HER2 e HER3 fortemente reguladas que permitem a ativação/inativação controlada destes recetores durante os procedimentos de panning. Para o conseguir, descobrimos primeiro que a linhagem celular VERO é uma linhagem celular apropriada para a expressão heterogénea de HER2 e HER3, e depois estabelecemos um painel de linhas celulares estáveis ??VERO expressando altos níveis de HER2 e HER3 isoladamente e em combinação. A linhagem celular aqui estabelecida; não só forneceu plataformas para métodos baseados na exibição de fagos, como também poderia ser utilizado em quaisquer estudos relacionados com HER e descoberta de medicamentos. O fator de crescimento epidérmico é uma proteína transmembranar e pertence à família de recetores ErbB, uma subfamília de quatro recetores tirosina-quinases estreitamente relacionados: EGFR (ErbB-1), HER2/neu (ErbB-2), Her 3 (ErbB-3 ) e Ela 4 (ErbB-4). Em muitos tipos de cancro, as mutações que afectam a expressão ou actividade do EGFR podem causar cancro. A deficiente sinalização do EGFR e de outros recetores tirosina-quinases em humanos está associada a doenças como a doença de Alzheimer, enquanto a sobreexpressão está associada ao desenvolvimento de uma grande variedade de tumores. A interrupção da sinalização do EGFR, quer bloqueando os locais de ligação do EGFR no domínio extracelular do recetor ou inibindo a atividade da tirosina quinase intracelular, pode prevenir o crescimento de tumores que expressam EGFR e melhorar a condição do doente. O ErbB2 não tem um ligante de ativação direta conhecido e pode estar num estado constitutivamente ativado ou tornar-se ativo durante a heterodimerização com outros membros da família, como o EGFR. O EGFR sofre uma transição após a ativação pelos seus ligantes do fator de crescimento. De uma forma monomérica inativa para um homodímero ativo, sofre uma transição. Embora haja evidências de que os dímeros inativos pré-formados também possam existir antes da ligação do ligante. Para criar um heterodímero ativado, o EGFR pode emparelhar com outro membro da família de recetores ErbB, como o ErbB2/Her2/neu, além de formar homodímeros após a ligação do ligante. A dimerização do EGFR estimula a sua atividade intrínseca da proteína tirosina quinase intracelular. No domínio C-terminal do EGFR ocorre a autofosforilação de vários resíduos de tirosina (Y). Estes incluem Y992, Y1045, Y1068, Y1148 e Y1173, como mostrado no diagrama ao lado. Esta autofosforilação induz a ativação e sinalização a jusante por várias outras proteínas que se associam às tirosinas fosforiladas através dos seus próprios domínios SH2 que se ligam à fosfotirosina. Estas proteínas de sinalização a jusante iniciam várias cascatas de transdução de sinal principalmente a MAPKVias Akt e JNK, levando à síntese de ADN e proliferação celular. Estas proteínas modulam fenótipos como a migração, adesão e proliferação celular. A ativação do recetor é importante para a resposta imunitária inata na pele humana. O domínio quinase do EGFR pode também cruzar resíduos de tirosina fosforilados de outros receptores com os quais está agregado, podendo ele próprio ser activado desta forma. O EGFR é essencial para o desenvolvimento ductal das glândulas mamárias e os agonistas do EGFR, como a anfiregulina, o TGF-α e a heregulina, induzem o desenvolvimento ductal e lobuloalveolar, mesmo na ausência de estrogénio e progesterona. A identificação do EGFR como um oncogene levou ao desenvolvimento de terapêuticas anticancerígenas para o EGFR (denominadas "inibidores do EGFR"), incluindo gefitinib, erlotinib, afatinib, brigatinib e icotinib para o cancro do pulmão e cetuximab para o cancro do cólon. Mais recentemente, a AstraZeneca desenvolveu o Osimertinib, um inibidor da tirosina quinase de terceira geração. Muitas abordagens terapêuticas têm como alvo o EGFR. O cetuximab e o panitumumab são exemplos de inibidores de anticorpos monoclonais. Contudo, o primeiro é do tipo IgG1, o último do tipo IgG2; as consequências na citotoxicidade celular dependente de anticorpos podem ser muito diferentes. O zalutumumab, o nimotuzumab e o matuzumab são os outros monoclonais em desenvolvimento clínico. As amplificações do gene EGFR são as amplificações mais comuns encontradas nos glioblastomas. As amplificações do EGFR são relativamente raras nos oligodendrogliomas, enquanto a sobreexpressão da proteína EGFR é uma característica comum dos oligodendrogliomas. Reifenberger et al. estudaram 13 oligodendrogliomas de grau II e 20 oligodendrogliomas anaplásicos de grau III para amplificação do gene EGFR. Observaram uma amplificação do gene EGFR num único tumor anaplásico. No entanto, Reifenberger et al. observaram também que a sobreexpressão do mRNA do EGFR é relativamente comum nos oligodendrogliomas de baixo e alto grau (seis dos 13 oligodendrogliomas e 10 dos 18 oligodendrogliomas anaplásicos). Os anticorpos monoclonais bloqueiam o domínio de ligação do ligante extracelular. Estando o local de ligação bloqueado, as moléculas sinalizadoras deixam de se conseguir ligar a este e ativar a tirosina quinase. Outro método utiliza pequenas moléculas para inibir a tirosina quinase EGFR, que se encontra no lado citoplasmático do recetor. Sem atividade de quinase, o EGFR é incapaz de ativar, o que é um pré-requisito para a ligação de proteínas adaptadoras a jusante. Na aparência, ao interromper a cascata de sinalização nas células que dependem desta via para o crescimento do tumor, a proliferação e a migração são reduzidas. Exemplos de inibidores de quinase de moléculas pequenas são o gefitinib, o erlotinib, o brigatinib e o lapatinib (um inibidor misto de EGFR e ERBB2). Existem vários métodos quantitativos que utilizam a deteção da fosforilação proteica para identificar inibidores da família EGFR. Novos medicamentos como o osimertinib, gefitinib, erlotinib e brigatinib têm como alvo direto o EGFR.Os doentes foram divididos em EGFR positivo e EGFR negativo, dependendo se um teste de tecido mostra uma mutação. Os doentes EGFR positivos demonstraram uma taxa de resposta de 60%, que excede a taxa de resposta da quimioterapia convencional, mas muitos doentes desenvolvem resistência. A mutação T790M e o oncogene MET são duas fontes principais de resistência. O efeito secundário mais comum dos inibidores do EGFR, encontrado em mais de 90% dos doentes, é uma erupção papulopustulosa que se espalha para a face e tronco; a presença da erupção cutânea está correlacionada com o efeito antitumoral do fármaco. Em 10% a 15% dos doentes, os efeitos podem ser graves e necessitar de tratamento.