Abstrato

Em Química orgânica 2018: Ferramentas químicas para sondar a ubiquitinação de proteínas - Jun Yin

 Jun Yin Professor Associado Georgia State University, EUA

 A ubiquitina (UB) é transferida por meio de uma cascata enzimática E1-E2-E3 para as proteínas do substrato para regular sua estabilidade e funções biológicas na célula. O genoma humano codifica 2 E1s, 45 E2s e mais de 600 E3s. Juntos, eles montam uma rede complexa de transferência de UB para a modificação de proteínas celulares. Atualmente, questões-chave não foram resolvidas sobre como identificar alvos de ubiquitinação de E3s importantes para mapeá-los nas redes de sinalização celular e como cadeias de UB de ligações específicas são montadas para codificar sinais únicos na célula. Desenvolvemos um método que chamamos de "transferência UB ortogonal" (OUT) para desembaraçar a complexidade das redes de ubiquitinação de proteínas. A chave para OUT é projetar uma cascata de enzimas E1, E2 e E3 projetadas (xE1, xE2 e xE3) que transfere exclusivamente um UB projetado (xUB) para os substratos de um xE3. Expressamos xUB e a cascata OUT na célula, purificamos proteínas conjugadas com xUB e revelamos suas identidades por proteômica. As proteínas da triagem OUT são os substratos potenciais do E3 na cascata OUT. Desenvolvemos cascatas OUT com HECT E3 E6AP e U-box E3s E4B e CHIP e identificamos novos circuitos celulares regulados por esses E3s. Para investigar o mecanismo de síntese da cadeia UB catalisada por E2, geramos conjugados di-UB específicos de ligação por incorporação de aminoácidos não naturais e ligação de proteína expressa. Os conjugados di-UB imitam os modos de ligação de UBs doadores e aceitadores no sítio ativo E2 para síntese da cadeia UB. Ao caracterizar a estrutura dos conjugados E2-diUB, revelaremos como E2 regula a síntese de cadeias UB de diferentes ligações. A ubiquitina (Ub) pode ser uma pequena proteína reguladora (8,6 kDa) de 76 aminoácidos que adota uma dobra β-grasp. Ub é muito conservada em organismos eucarióticos. A conjugação da ubiquitina a uma proteína alvo é denominada ubiquitinação ou ubiquitilação.1 Normalmente, Ub é anexado a proteínas por meio de uma ligação isopeptídica entre o carboxilato C-terminal da ubiquitina (glicina 76) e um grupo ε-amino de um resíduo de lisina dentro das proteínas aceitadoras. A ubiquitinação é uma modificação pós-traducional (PTM) crucial e reversível em células eucarióticas. Desde sua descoberta no final da década de 1970 e início da década de 1980, a modificação pela ubiquitina surgiu como um importante mecanismo regulador na maioria dos processos celulares em eucariotos. A ubiquitinação afeta proteínas do substrato de muitas maneiras diferentes, incluindo sinalização, degradação proteassomal, alteração da localização celular, modulação da atividade catalítica e promoção ou prevenção de interações proteicas.2, 3 Os processos celulares regulados pela ubiquitinação incluem ciclo celular, transcrição, tráfico, inflamação e reparo de DNA. Notavelmente, muitos dos processos são independentes da degradação proteica mediada por proteassoma. A ubiquitinação envolve três etapas enzimáticas principais catalisadas por enzimas ativadoras de ubiquitina (E1s), enzimas conjugadoras de ubiquitina (E2s),e ubiquitina ligases (E3s) (ver Fig. 1).5 Primeiro, a ubiquitina é ativada durante uma reação de duas etapas por uma E1 (enzima ativadora de ubiquitina) com o consumo de ATP, formando um intermediário adenilato de ubiquitina e, subsequentemente, uma ligação tioéster entre o carboxil C-terminal da ubiquitina e, portanto, o sítio cisteína de E1. O genoma humano contém dois E1s, ou seja, UBA1 e UBA6.8 E2 catalisa a transferência de Ub do conjugado Ub-E1 para o sítio cisteína de E2 e forma o conjugado Ub-E2 por meio de uma reação de transtioesterificação. O genoma humano possui cerca de 30 enzimas E2 diferentes. A ubiquitina ligase E3 catalisa a etapa final da cascata de ubiquitinação transferindo Ub do conjugado Ub-E2 para a proteína substrato. E3s têm especificidade de substrato para as enzimas E2. As ligases cullin-RING, que constituem o grupo mais importante de E3s (cerca de 600 membros), não formam uma ligação química com Ub. Dois grupos menores de E3s, as ligases HECT (cerca de 30 membros) e as ligases RBR (cerca de 12 membros), formam um intermediário Ub-tioéster com o sítio E3 cisteína