Jun-ichi Kadokawa
Este artigo relata um exame da fosforólise enzimática de substratos oligo-d-glucosaminídeos conectados a α(1→4) por catálise termoestável de α-glucano fosforilase (de Aquifex aeolicus VF5). A α-glucano fosforilase catalisa tanto a fosforólise quanto a glicosilação/polimerização na extremidade não redutora de substratos de glicose conectados a α(1→4) dependendo das condições. Os criadores também descobriram que o polímero d-glucosaminídeo conectado a α(1→4) (estereoisômero de quitosana) foi obtido pela polimerização enzimática termoestável catalisada por α-glucano fosforilase de α-d-glucosamina 1-fosfato de um maltooligossacarídeo preliminar. Na investigação atual, esperamos descobrir se o composto catalisa a fosforólise de substratos contendo tais cadeias de d-glucosaminídeos. Os substratos oligo-d-glucosaminídeos conectados a α(1→4) estendidos da maltotriose foram primeiramente arranjados pela polimerização enzimática catalisada por α-glucano fosforilase termoestável de α-d-glucosamina 1-fosfato da limpeza preliminar e resultante da maltotriose por HPLC preparativa. A fosforólise dos substratos subsequentes é direcionada à vista da α-glucano fosforilase termoestável na almofada de fosfato. As consequências expositivas dos itens sustentaram completamente o evento de fosforólise na extremidade não redutora de ambas as cadeias de sucessões de d-glucosamina-α(1→4)- d-glucosamina e d-glucosamina-α(1→4)- d-glicose. A polimerização enzimática foi distinguida como uma maneira incrível de lidar com a polimerização integrada composta de sistema de som e ligações glicosídicas controladas por região [1-6]. A α-Glucan fosforilase é um dos produtos químicos que tem sido utilizado para todos os efeitos como um ímpeto para a polimerização enzimática para criar polissacarídeos totalmente caracterizados. A α-Glucan fosforilase catalisa a fosforólise in vivo de α(1→4)-glucanos, por exemplo, amilose e glicogênio na extremidade não redutora na visão do fosfato inorgânico (Pi) para fornecer α-D-glicose 1-fosfato (Glc-1-P). Devido à reversibilidade dessa resposta fosforolítica, esse catalisador também catalisa a glicosilação in vitro de α(1→4)-glucano como um aceitador de glicosil, por exemplo, maltooligossacarídeo utilizando Glc-1-P como um doador de glicosil para criar ligação α(1→4)-glicosídica com Pi liberador. A resposta reversível pela catálise da α-glucano fosforilase é resumida da seguinte forma; [α (1→4)- Glc]n+1+Pi → [α (1→4)- Glc]n+Glc-1-P. Sob as condições nas enormes proporções doador/aceitador, glicosilações progressivas na extremidade não redutora de alongamento do maltooligossacarídeo como base acontecem pela catálise da α-glucano fosforilase, levando à polimerização enzimática para fornecer polissacarídeo conectado (1→4), ou seja, amilose. O nível de polimerização (DP) da amilose pode ser restringido pela proporção de alimentação doador/aceitador. As α-glucano fosforilases mostraram a particularidade diversa para o reconhecimento de substratos, dependendo de suas fontes.Por exemplo, os menores substratos percebidos pela α-glucano fosforilase mais amplamente reconhecida desvinculada de (α-glucano fosforilase da batata) em respostas de fosforólise e glicosilação são normalmente maltopentaose (Glc5) e maltotetraose (Glc4), separadamente. Por outro lado, Glc4 e maltotriose (Glc3) são os menores substratos percebidos pela α-glucano fosforilase segregada de fontes bacterianas termofílicas (α-glucano fosforilase termoestável) em respostas de fosforólise e glicosilação, individualmente. Além disso, as α-glucano fosforilases são conhecidas por mostrar frágil explicitude para o reconhecimento de substratos, o que também foi visto como dependente de suas fontes. A α-glucano fosforilase da batata catalisa glucosaminilações enzimáticas utilizando α-D-glucosamina 1-fosfato (GlcN-1-P) e seu subordinado, N-formil-α-D-glucosamina 1-fosfato (GlcNF-1-P), como benfeitores glicosil não locais no berço de derivação de ácido acético para fornecer oligossacarídeos com uma unidade GlcN(F) na extremidade não redutora, enquanto glucosaminilações progressivas utilizando GlcN-1-P ocorrem por catálise de α-glucano fosforilase termoestável (de Aquifex aeolicus VF5) no suporte de derivação de ácido acético, oferecendo ascensão a cadeias oligo-GlcN conectadas a α(1→4) na extremidade não redutora de aceitadores de glicosil, por exemplo, Glc3, o menor aceitador de glicosil para este catalisador. Com a expansão da proporção de alimentação benfeitora/aceitadora, não obstante, as estimativas de DP das cadeias α(1→4)-GlcN mantiveram todas as coisas consideradas cinco. Este resultado demonstrou que o prolongamento da cadeia foi impedido pelo Pi criado a partir de GlcN-1-P, uma vez que é um substrato local para fosforólise pela catálise da α-glucano fosforilase. Um esforço foi então feito para expulsar Pi como um acelerador do campo de glucosaminilação enzimática, reproduzindo a resposta em um suporte de amônio (0,5 M, pH 8,5) contendo MgCl2, à luz do fato de que a distribuição anterior revelou que Pi forma um sal insolúvel com partículas de amônio e magnésio. Assim, as glucosaminilação enzimáticas progressivas foram aceleradas na estrutura do berço para ocorrer a polimerização de GlcN-1-P a partir da base Glc3, oferecendo ascensão ao polímero D-glucosaminida conectado a α(1→4), que comparado à estrutura de um estereoisômero de quitosana]. Com base nos resultados acima, supomos que a α-glucano fosforilase termoestável catalisa a glucosaminilação utilizando GlcN-1-P, mas também a fosforólise na extremidade não redutora da cadeia de glucosaminida conectada a α(1→4), dependente da centralização de Pi. Além disso, foi contabilizado que a α-glucano fosforilase termoestável (de Escherichia coli) mostrou as práticas sinérgicas distintas em direção à fosforólise e glicosilação dependendo das condições de resposta. No artigo atual,relatamos o exame exato para descobrir se a α-glucano fosforilase termoestável catalisa a fosforólise de substratos oligo-D-glucosaminídeos-maltotriose conectados a α(1→4) (GlcNm-Glc3). Originalmente, organizamos os substratos oligo-D-glucosaminídeos-maltotriose conectados a α(1→4) para a fosforólise, ou seja, tetrahexassacarídeos (GlcN-Glc3, GlcN2-Glc3 e GlcN3-Glc3) pela polimerização enzimática catalisada por fosforilase termoestável de GlcN-1-P, conforme indicado pelo procedimento de escrita. O menor substrato, Glc3, foi utilizado como introdução para a polimerização para evitar o evento de fosforólise da base, tendo em vista que o composto não catalisa sua fosforólise. A resposta foi acionada na proporção de alimentação GlcN-1-P/Glc3 de 10:1 dentro da visão da α-glucano fosforilase termoestável em berço alcalino (pH 8,5) contendo partícula Mg2+ a 40°C por 48 h. O tempo de resposta mais curto foi utilizado nesta investigação do que a condição de escrita (7 dias) para fornecer GlcNm-Glc3 com pequenas estimativas de DP. O MALDI-TOF MS do item bruto após o tratamento com GA observa alguns pináculos relacionados às massas subatômicas de oligossacarídeos contendo uma a cinco unidades GlcN. apoiando a criação do GlcNm-Glc3 mais curto do que os itens de escrita (m = ~ 12). Além disso, o resultado do MALDI-TOF MS demonstra adicionalmente nenhum evento da hidrólise do tipo exo na seção Glc3 nos oligossacarídeos criados pela catálise GA, recomendando a proximidade das cadeias GlcN na extremidade não redutora do Glc3. O cromatograma HPLC após o equilíbrio do item com corrosivo clorídrico mostra os pináculos plurais relacionados aos oligossacarídeos com vários DPs. Conforme necessário, as partes de um pináculo A relacionado a um tetrassacarídeo e pináculos B e C comparados a penta e hexassacarídeos foram reunidos por HPLC preparativa. O MALDI-TOF MS das partes anterior e final mostra topos relacionados às massas atômicas de GlcN-Glc3 e GlcN2-Glc3/GlcN3-Glc3, individualmente, demonstrando que o tetrassacarídeo e uma mistura dos penta e hexassacarídeos foram efetivamente separados.O MALDI-TOF MS do item bruto após o tratamento com GA observa alguns pináculos relacionados às massas subatômicas de oligossacarídeos contendo uma a cinco unidades GlcN, apoiando a criação do GlcNm-Glc3 mais curto do que os itens de escrita (m = ~ 12). Além disso, o resultado do MALDI-TOF MS também não demonstra nenhum evento da hidrólise do tipo exo na seção Glc3 nos oligossacarídeos criados pela catálise GA, recomendando a proximidade das cadeias GlcN na extremidade não redutora de Glc3. O cromatograma HPLC após o equilíbrio do item com corrosivo clorídrico mostra os pináculos plurais relacionados aos oligossacarídeos com vários DPs. Conforme necessário, as partes de um pináculo A relacionadas a um tetrassacarídeo e os pináculos B e C em comparação aos penta e hexassacarídeos foram reunidos por HPLC preparativa. O MALDI-TOF MS das partes anterior e final mostra topos relacionados às massas atômicas de GlcN-Glc3 e GlcN2-Glc3/GlcN3-Glc3, individualmente, demonstrando que o tetrassacarídeo e uma mistura de penta e hexassacarídeos foram efetivamente separados.O MALDI-TOF MS do item bruto após o tratamento com GA observa alguns pináculos relacionados às massas subatômicas de oligossacarídeos contendo uma a cinco unidades GlcN, apoiando a criação do GlcNm-Glc3 mais curto do que os itens de escrita (m = ~ 12). Além disso, o resultado do MALDI-TOF MS também não demonstra nenhum evento da hidrólise do tipo exo na seção Glc3 nos oligossacarídeos criados pela catálise GA, recomendando a proximidade das cadeias GlcN na extremidade não redutora de Glc3. O cromatograma HPLC após o equilíbrio do item com corrosivo clorídrico mostra os pináculos plurais relacionados aos oligossacarídeos com vários DPs. Conforme necessário, as partes de um pináculo A relacionadas a um tetrassacarídeo e os pináculos B e C em comparação aos penta e hexassacarídeos foram reunidos por HPLC preparativa. O MALDI-TOF MS das partes anterior e final mostra topos relacionados às massas atômicas de GlcN-Glc3 e GlcN2-Glc3/GlcN3-Glc3, individualmente, demonstrando que o tetrassacarídeo e uma mistura de penta e hexassacarídeos foram efetivamente separados.
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